Công Thức Môi Trường Nuôi Cấy Vi Sinh Vật

Lĩnh vực vi sinh vật học đã được hình thành và phát triển tới nay hơn mấy trăm năm. Hiện tại, các nhà khoa học có thể phân lập và nuôi cấy rất nhiều chủng loại vi khuẩn ở các điều kiện và vị trí địa lý rất khác nhau. Vì thế, môi trường nuôi cấy vi khuẩn, nấm ngày càng phát triển để đáp ứng cho từng loại sinh vật cụ thể. Thành phần từng loại môi trường có thể khác nhau tuy nhiên đều có nguyên lý chung để tạp lập nên những công thức môi trường nuôi cấy vi sinh vật này. Trong bài này chúng tôi sẽ giới thiệu thành phần và vai trò của chúng trong các môi trường nuôi cấy vi khuẩn, nấm.

Công thức môi trường nuôi cấy vi sinh

Có rất nhiều thành phần trong một môi trường nuôi cấy vi khuẩn hoặc nấm và nó khác nhau cho từng đối tượng. Tuy nhiên, chúng ta có thể chia ra thành bảy nhóm thành phần với vai trò khác nhau như sau:

1 Chất cung cấp dinh dưỡng: protein/peptide/amino-acid

2 Chất cung cấp năng lượng: carbohydrate

3 Kim loại và khoáng chất thiết yếu: can-xi, magiê, sắt, kim loại vi lượng: phosphate, sulphate…

4 Hệ đệm: phosphate, acetate…

5 Chất chỉ thị thay đổi pH: phenol đỏ, bromo-cresol purple…

6 Tác nhân chọn lọc: hoá chất, kháng sinh

7 Tác nhân làm đông cứng môi trường: luôn là thạch (agar)

Thông thường sẽ có một sự chồng lấn về chức năng của một số thành phần trong môi trường nuôi cấy, như dịch thuỷ phân protein sẽ cùng cấp nitơ, năng lượng, một số kim loại và khoáng chất và còn hoạt động như cả hệ đệm. Hệ đệm Phosphate là nguồn cung cấp quan trọng của khoáng và thạch bổ sung kim loại.

Chất dinh dưỡng

Naegeli được ghi nhận là người có các ấn phẩm khoa học sớm nhất (1880/82) mà mô tả nhu cầu của vi sinh vật với thành phần protein. Ông đã gọi thành phần này là “peptone“. Công trình nghiên cứu sau đó cho thấy rằng nhóm vi khuẩn này là chemoorganotrophs, cần các hợp chất nitơ trong amino acid như là các nhân tố sinh trưởng cần thiết trong môi trường nuôi cấy của chúng.

Chiết xuất thịt (cao thịt) có chứa các phân đoạn của protein tan trong nước (các amino acid và peptide nhỏ) cùng với các sản phẩm tan trong nước khác như vitamin, kim loại vi lượng, khoáng chất và carbohydrate (glycogen). Chiết xuất này có thể được coi là “peptone” nhưng thành phần nitơ từ amino acid của chúng luôn rất thấp nên không thể duy trì sự sinh trưởng của số lượng lớn vi khuẩn. Trước đây do chưa thể sản xuất đủ lượng protein để thuỷ phân cho môi trường nuôi cấy vi khuẩn, nhiều môi trường sử dụng hỗn hợp của protein được thuỷ phân (peptone) và cao thịt.

Người ta nhận thấy việc sản xuất dung dịch thuỷ phân protein là rất khó khăn, do đó nhiều nhà sản xuất thương mại sản phẩm này đã được thành lập vào năm 1920. Những sản phẩm peptone thương mại thường được sản xuất dưới dạng khô và cũng từ đó các môi trường nuôi cấy thương mại dạng khô được sản xuất và bán phổ biến trên thị trường.

Mặc dù nguồn protein phổ biến và rõ ràng nhất là từ thịt, do đó dễ hiểu ban đầu người ta chủ yếu thuỷ phân và tạo peptone từ nguồn này. Tuy nhiên, sau dó các nhà khoa học có thử nghiệm để tạo ra peptone từ một số nguồn khác và thấy được những ích lợi cụ thể, những nguồn này hiện vẫn còn được sử dụng tới ngày nay. Ví dụ, dịch thuỷ phân Casein với màu nhạt và hàm lượng tryptophan cao và peptone hạt đậu tương với thành phần carbonhydrate năng lượng cao là nguồn peptone phổ biến mà không phải thịt.

Các thành phần dinh dưỡng của môi trường nuôi cấy thường được lựa chọn cẩn thận để thu hồi được phổ vi sinh vật mong muốn trong mẫu. Môi trường có mục tiêu chung như thạch máu sẽ thường chứa hỗn hợp peptone để đảm bảo rằng peptide đủ đa dạng cho phần lớn vi sinh vật có khả năng có mặt. Tuy nhiên, các sinh vật đòi hỏi khắt khe hơn sẽ yêu cầu bổ sung các nhân tố sinh trưởng, ví dụ như môi trường dành cho nuôi các loài Legionella. 

Hầu hết các thành phần được sử dụng cho nuôi dưỡng vi sinh vật là không xác định và yêu cầu kiểm tra mở rộng với sự lựa chọn cẩn thận để đảm bảo mức độ đồng nhất cao. Người ta cũng đã đặt câu hỏi răng liệu có tốt hơn nếu sử dụng toàn bộ peptide và amino acid xác định để tạo một môi trường có thành phần rõ ràng? Tuy nhiên, trong thực thế dù môi trường này có đồng nhất hơn nhưng chúng cho thấy hiệu quả kém so với môi trường khác. Hơn nữa, giá thành của những môi trường này cũng đắt so với các môi trường không xác định. Việc sử dụng môi trường nuôi cấy hoàn toàn xác định là mục tiêu dễ hiểu của hầu hết các nhà vi sinh vật học nhưng môi trường này vẫn chưa chứng minh được hiệu quả bằng những hỗn hợp phức tạp của dịch thuỷ phân protein trong thịt và thực vật.

Chất cung cấp năng lượng

Hợp chất phổ biến nhất được bổ sung vào môi trường nuôi cấy để phục vụ như nguồn cung cấp năng lượng và để tăng tỷ lệ sinh trưởng của vi sinh vật là glucose. Các hợp chất carbonhydrate khác như lactose hoặc L-arabinose có thể được sử dụng cùng hoặc thay thế trong một số trường hợp.

Carbohydrate được bổ sung vào môi trường mở mức 5-10 g trên lít luôn có mặt như các cơ chất hoá sinh để xác định việc sản xuất của các enzyme cụ thể trong định danh sinh vật. Chất chỉ thị pH luôn được bổ sung vào những công thức môi trường này.

Kim loại và các chất khoáng cần thiết

Các thành phần vô cơ cần thiết của môi trường nuôi cấy rất nhiều và có thể được phân chia dựa trên cơ sở bán định lượng:

• Các thành phần chiếm lượng lớn điển hình (g/lít): Na, K, Cl , P, S, Ca, Mg, Fe.
• Những thành phần có lượng nhỏ (microgam/lít): Zn, Mn, Br, B, Cu, Co, Mo, V, Sr…

Như đã được đề cập ở bên trên, một công thức có thể không có các kim loại và khoáng chất cụ thể được liệt kê trong công thức môi trường của nó. Trong những trường hợp này người ta giả thiết rằng những nhân tố cần thiết có mặt trong mẫu thuỷ phân protein, đệm và thạch.

Hệ đệm

Điều quan trọng là luôn giữ pH môi trường xung quanh mức tối ưu cần thiết cho sự sinh trưởng của vi sinh vật muốn phân lập. Việc sử dụng các hợp chất đệm ở giá trị pK cụ thể là đặc biệt cần thiết khi loại carbonhydrate có thể lên men được bổ sung vào môi trường như nguồn cung cấp năng lượng.

Những hợp chất phổ biến mà được bổ sung vào môi trường nuôi cấy là phosphate, acetate, citrate, ion lưỡng tính (zwitterion) và một số amino acid đặc biệt khác. Một ảnh hưởng phụ của những hợp chất này là khả năng bắt giữ ion dương hoá trị 2 (chelate) như Ca ++ và Mg ++. Các muối polyphosphate, đôi khi có mặt trong sodium phosphate, là các hợp chất mà có thẻ gắn với các ion dương cần thiết quá yếu đến nỗi khiến chúng không thể tiếp cận được đến những vi sinh vật có nhu cầu.

Ảnh hưởng của những tác nhân gắn kết và chelate hoá này sẽ được thấy trong sự phát triển giảm dần hoặc hoàn toàn không phát triển được, trừ khi bổ sung thêm các ion cần thiết vào công thức môi trường nuôi cấy. Tình trạng mờ đục hình thành trong môi trường sau khi đun nóng hoặc giữ ở 50°C trong vài giờ, hiện tượng này gây ra bởi tương tác của phosphate với kim loại. Những chất tủa phosphate này có thể gắn với Fe rất hiệu quả và làm giảm lượng kim loại thiết yếu này trong môi trường.

Chất chỉ thị

Việc bổ sung của chất chỉ thị có màu là một cách rất hiệu quả để xác định sự lên men của các carbonhydrate đặc biệt trong môi trường nuôi cấy. Những hợp chất này nên thay đổi màu khác biệt và nhanh chóng ở mức pH quan trọng.

Các hợp chất được sử dụng phổ biến như là chất chỉ thị màu trong môi trường bao gồm: phenol red, bromo-cresol purple, fuchsin… Những chất này là độc và quan trọng phải sử dụng ở nồng độ thấp và cần sàng lọc trước mỗi mẻ. Các chủng vi sinh nhạy cảm đã được biết được sử dụng trong các thử nghiệm sàng lọc này.

Tác nhân chọn lọc

Các hoá chất hoặc kháng sinh được bổ sung vào môi trường nuôi cấy để giúp chúng có khả năng chọn lọc những loài vi sinh vật xác định. Những tác nhân chọn lọc được chọn và được bổ sung ở nồng độ cụ thể nhằm ức chế sự sinh trưởng của sinh vật không mong muốn trong một mẫu nhiều loài. Dĩ nhiên, cần xác định được nồng độ thích hợp của tác nhân chọn lọc để không ngăn cản sự phát triển của vi khuẩn muốn phân lập.

Các tác nhân chọn lọc hoá học phổ biến gồm: muối mật, dye-stuffs, selenite, tetrathionate, tellurite và azide. Các chất kháng sinh được sử dụng phổ biến trong hỗn hợp khi ức chế nhiều loại vi khuẩn đường ruột nhiễm vào mẫu. Chất kháng sinh thì đặc hiệu hơn trong hoạt động chọn lọc so với các tác nhân hoá học bên trên. Tuy nhiên, trọng lượng thấp và khả năng chịu nhiệt kém của hầu hết các loại kháng sinh yêu cầu việc pha chế môi trường thật thận trọng và cần bổ sung sau khi đã khử trùng.

Sự đa dạng lớn của các loài vi sinh vật và khả năng thích nghi dường như vô tận với thay đổi điều kiện khiến cho tạo một môi trường chọn lọc hoàn toàn là không thể. Môi trường chọn lọc có thể được nói để ức chế hầu hết vi khuẩn không mong muốn và cho phép hầu hết vi khuẩn mong muốn phát triển. Công thức cuối cùng luôn là một sự hài hoà để đạt được tiêu chí tốt nhất.

Tác nhân đông cứng hoặc gel hoá

Mặc dù gelatin vẫn được sử dụng trong một số môi trường đặc biệt và carrageenan, alginate, silica gel và polyacrylamide đôi khi cũng được sử dụng làm tác nhân gel hoá, tác nhân mà được sử dụng phổ biến nhất trong môi trường nuôi cấy vẫn là thạch. Hesse, một kỹ thuật viên trong phòng thí nghiệm của Robert Koch, được công nhận là người đầu tiên sử dụng thạch vào trong môi trường nuôi cấy, mặc dù Frau Hesse đưa ông ý tưởng từ việc sử dụng nó trong các loại thạch để bàn ở vùng nhiệt đới.

Agar có một đặc tính trơ đặc biệt với hoạt động của vi sinh vật, hơn nữa nó có độ nóng chảy là 84°C cùng với độ bền của gel cao cho phép sử dụng nó với nồng độ thấp. Độ trong và độc tính thấp của nó khiến nó trở nên phổ biến và được các nhà vi sinh vật học lựa chọn sử dụng. Hơn nữa, thạch có khả năng giữ được cấu trúc gel ngay cả ở 60°C khiến nó được lựa chọn cho vào môi trường nuôi cấy để phân lập những vi khuẩn ưa nhiệt.

Agar được thu nhận từ các loài rong biết chủ yếu là Gelidium, Gracilaria và Pterocladia. Nó được tách chiết như dung dịch ở hơn 100°C, khử màu, lọc, sấy khô và cuối cùng là nghiền thành dạng bột.

Thạch Agar không hẳn là một tác nhân gel hoá trơ, nó có đóng góp chất dinh dưỡng/ hoặc chất độc với môi trường nuôi cấy, điều này phụ thuộc vào quá trình xử lý được thực hiện bởi các nhà cung cấp. Thạch nuôi cấy vi sinh được xử lý đặc biệt để dẫn tới gel độc thấp, độ trong cao, khoáng thấp và gel khuếch tán cao.

Các thành phần khác

Có nhiều chất khác có thể được bổ sung vào môi trường nuôi cấy cho các mục đích cụ thể. Ví dụ, các nhân tố sinh trường cho các sinh vật khó tính, các hợp chất khử eH đối với sinh vật kỵ khí (thioglycollate và cysteine), máu toàn phần để xác định các enzyme tan máu và khuyến khích sự phát triển của các sinh vật mà bị tổn thương bởi sản phẩm oxy hoá.

Đây là bài viết về nguyên lý của công thức môi trường nuôi cấy vi sinh vật. Bài viết này chúng tôi dựa vào bài gốc trên trang của hãng Oxoid. Chúng tôi hy vọng bài viết này sẽ hữu ích với quí khách hàng.